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實時熒光定量PCR的優(yōu)化（一）

發(fā)布時間： 2021-10-12　　點擊次數(shù)： 2295次

如果是病毒定量和SNP基因分型的實時熒光定量PCR，我們需要盡可能高特異性；如果是病原體、mRNA檢測，我們需要高靈敏度。

想要提高PCR擴增效率、特異性及靈敏度，我們可以通過一系列措施優(yōu)化實時熒光定量PCR實驗。首先是靶序列的選擇。

1、選擇的靶序列合適長度在50～150bp之間。較短的序列合成耗時短，擴增時間縮短，因此污染DNA被擴增的可能性降低。

2、選擇靶序列時，使用BLAST檢索分析靶序列是否存在多態(tài)性和測序錯誤，并避開。如果靶序列中出現(xiàn)重復序列，會降低PCR檢測靈敏度，也應(yīng)該避開。

3、控制靶序列中GC含量≤60%。高GC含量，會影響靶序列在熱循環(huán)中的變性，也容易產(chǎn)生非特異性擴增。

4、避免產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)。靶序列如果有反向重復的序列，容易產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)，影響引物、探針的雜交。

除此以外，我們還需要保證模板的質(zhì)量不會影響擴增，實時熒光PCR的結(jié)果才有可靠性。例如損傷的DNA在PCR中不能充分擴增，或者根本不能擴增。同時，如果模板中存在抑制DNA聚合酶的試劑（DMSO等）和污染物（SDS等），也會影響PCR的可靠性。

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