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冰凍切片的原位雜交實驗

發(fā)布時間： 2022-03-24　　點擊次數(shù)： 1593次

材料與儀器

冰凍切片
Tris·Cl EDTA 甘氨酸 PBS SSC 乙醇甲酰胺硫酸葡聚糖 DTT NaCl
加濕盒水浴鍋培養(yǎng)箱

步驟

1. 從冰箱中取出載玻片，平衡至室溫，再打開玻片盒。置載玻片于架中，浸泡于以50 mmol/l Tris·Cl（pH7.5）/5 mmol/l EDTA所配的鏈霉蛋白酶液中，放10 min。

2. 室溫下將載玻片浸于含2 mg/ml 甘氨酸的PBS中30 s，然后再于PBS中浸2次，毎次30 s。

3. 浸載玻片于新配的TEA緩沖液中5 min。

4. 在一個燒杯中，配足量TEA緩沖液以沒過載玻片。加乙酸肝至終濃度0.25%，迅速倒在載玻片上，晃動玻片架使液體充分混合，放置10 min。

5. 在2×SSC中洗載玻片2次，每次5 min。

6. 按順序經(jīng)30%、60%、80%、95%和100%乙醇依次縵泡脫水，每次浸2 min，干燥切片并馬上用于雜交。

7. 沉淀標記的DNA或RNA探針。確定標記摻入的百分率（比活）并估計合成的探針量，并按最終每千堿基0.2 μg/ml 的濃度，估算雜交混合液的終體積，依此重懸探針沉淀。

8. 首先以2份雜交混合液B及2份去離子的甲酰胺重懸探針沉淀，隨后加1份50%硫酸葡聚糖，充分混合。

9. 標記的DNA探針煮沸2 min，馬上置于冰?。换蛴?0℃加熱標記的RNA探針30 s，維持于50℃。熱變性后，加3.3 mol/l DTT至50 mmol/l 終濃度。用加樣吸頭，加足量探針充分覆蓋切片。

10. 玻片放入密封閉良好的加濕盒中溫育4 h，加濕盒中加有加濕盒液B。探針于37 ℃溫育探針于42℃溫育。

11. 對DNA探針：以預(yù)熱至37℃的DNA洗液洗2 h，其間換洗液4~5次。

12. 對RNA探針：

（1）在預(yù)熱至50℃的RNA洗液1中洗15 min，至少洗2次。

（2）玻片在37℃的含20 μg/ml 經(jīng)煮沸處理RNA酶A的0.5 mol/l NaCl / 10 mmol/l Tris·Cl（pH8.0）液中溫育15 min。

（3）在預(yù)熱至50℃的RNA洗液1中冼15 min至少洗2次。

（4）在預(yù)熱至50℃的RNA冼液2中冼15 min，換液2次，（如需要的話，洗片溫度可髙至60℃，不過對形態(tài)學(xué)結(jié)果可能有影響）。

13. 在以下各溶液中依次浸泡脫水，每次浸泡2 min：含0.6 mol/l NaCl 的30%乙醇、含0.6 mol/l NaCl 的60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。

14. 于空氣中干燥切片后，經(jīng)放射自顯影檢測雜交的探針。

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