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    蛋白質(zhì)合成實驗

    發(fā)布時間: 2022-12-05  點擊次數(shù): 909次

    材料與儀器

    步驟


    材料

    無菌

    細胞培養(yǎng),如 1X104~ 1X106 個細胞,24 孔板
    3H-亮氨酸。無血淸培養(yǎng)基中 2 MBq /ml (~50uCi/ml) (特異活性并不重要,因為它將由培養(yǎng)基中的亮氨酸濃度決定)

    非無菌

    SLS 或 SDS,1% (35m mol/L ) 溶于 0 .3 mol/L NaOH
    三氯醋酸(TCA)
    液閃瓶
    Eppendorf 管
    閃爍液,最小含水為 10%

    操作步驟

    1. 細胞生長至所需密度。

    2. 從孵箱中取出培養(yǎng)板,加人預(yù)溫的溶于培養(yǎng)液或 BSS 中的放射性同位素,稀釋度為 1:10 (如 l00ul/ml/孔)。

    3. 盡快地將細胞放回孵箱。

    4 . 繼續(xù)培養(yǎng) 4~24 h。

    提示: 不同的蛋白質(zhì)更新率不盡相同。本操作程序并不針對任何特定的一種蛋白質(zhì),而可用于快速生長細胞中的總蛋白。當(dāng)?shù)谝淮斡脕頊y定一個細胞系的蛋白質(zhì)合成時,要核實合成率在所選的孵育時間內(nèi)是否呈線性。如果氨基酸池比飽和時低,可發(fā)生延遲。

    5 . 從孵箱中取出培養(yǎng)物,小心從孔中吸去培養(yǎng)液至適當(dāng)?shù)膹U棄放射性液體容器中(見 7.7.2 節(jié))。
    1. 用冷 HBSS 或 D-PBSA 輕輕地清洗細胞。

    提示 某些單層培養(yǎng),特別是一些松散貼附的連續(xù)細胞系,諸如 HeLa-S , 可能在清洗時便離散開來。如遇這種情況,移去同位素,并加入甲醇,將單層固定,靜止 lO min,小心地移走甲醇,令其晾干。

    7.將培養(yǎng)板置于冰上,加人 0.6mol/L TCA ,于 4°C 靜置 lO min ,:然后吸去所有未摻入的前體物。

    8. 重復(fù)第七步 2 次,但每次只許 5 min 。

    9 . 以 MeOH 清洗培養(yǎng)物,晾干培養(yǎng)板。

    10.加人 0.5 ml 0.3mol/L NaOH ,內(nèi)含 1% SLS,室溫下靜置 30 min 。

    11. 混合每孔中的培養(yǎng)物,將它們移人液閃瓶中。

    12. 加入 5m l 閃爍液,在閃爍儀中計數(shù)。

    提示: 生物降解性閃爍劑(如 Ecoscint),比以甲苯或二甲苯為基礎(chǔ)的閃爍液更好,因為只要是放射活性低于規(guī)定量,前者毒性較小,可以與大量的水一起倒入水池 中。對于懸浮培養(yǎng)的細胞,在第 5 步用 1000 g 離心 l0 min ,去除培養(yǎng)基,除了第 9 步外 6,7 ,8 也須重復(fù)此步驟,第 9 步的培養(yǎng)板也可在磷光成像儀(phosphorimager) 上直接定量測定。



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