一、準備工作

1. 試劑準備：培養(yǎng)細胞所需的培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清（簡稱FBS）、雙抗（簡稱P/S）、PBS緩沖液等從4°C的冰箱中取出，于室溫條件下放置至恢復室溫。

2. 耗材準備：50ml離心管、15ml離心管及移液槍。

3. 實驗條件準備：打開超凈臺紫外線照射30min之后通風3-5min即可開始實驗。

二、實驗步驟

1.潔凈要求：進入細胞間后，穿好實驗服，戴好口罩手套等實驗裝備，將上述試劑耗材用酒精噴洗后放入超凈臺，手部同樣酒精噴洗后放入超凈臺，手部同樣酒精噴洗即可開始。

2.試劑分裝及配制：

（1）配制（血清）細胞培養(yǎng)基：（血清）細胞培養(yǎng)基（血清占總體積10%，雙抗占總體積1%的基礎培養(yǎng)基混合液）一般用50ml離心管配制，減少污染的概率。即在50 ml離心管中加入5ml FBS和500μL P/S后倒入基礎培養(yǎng)基定容到50ml，即得50ml（血清）細胞培養(yǎng)基。用馬克筆在離心管壁上寫好配制時間及溶液成分。放于一旁試劑架上備用。

（2）分裝PBS：將PBS從瓶中倒入50ml離心管中，倒PBS時注意瓶口和管口不要接觸，防止整瓶污染。標記好后也置于試劑架上備用。

3.細胞消化及傳代：

（1）細胞狀態(tài)的觀察及傳代準備：手部酒精噴洗后，將細胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶從恒溫培養(yǎng)箱中取出，于倒置顯微鏡下觀察細胞密度，已經(jīng)生長到80%-90%的細胞密度即可傳代。手部再次酒精噴洗，順便將培養(yǎng)皿也噴一下，放入超凈臺。

（2）清洗：先用移液槍移除原有細胞培養(yǎng)液，更換槍頭后加入2ml PBS清洗1~2次（沿培養(yǎng)皿壁處加入，防止沖散貼壁細胞，加入后輕輕搖蕩，洗去殘余的培養(yǎng)液和懸浮的細胞），用移液槍移除PBS；注意棄掉PBS時，槍頭應在廢液缸上方，不要將槍頭伸入廢液缸中，防止回濺造成污染。

（3）消化：沿培養(yǎng)皿側壁加入1-2ml胰酶（能夠覆蓋細胞表面即可）消化約2-5min（水解細胞間蛋白質，使貼壁細胞脫離附著的底物，解離、分散細胞），在倒置顯微鏡下觀察到細胞形態(tài)由不規(guī)則逐漸皺縮為圓形即為全部消化。

（4）終止消化：加入3ml（血清）細胞培養(yǎng)基或將加入的胰酶棄去均可終止胰酶消化。用移液槍反復吹打培養(yǎng)皿皿底壁或培養(yǎng)瓶底壁使細胞脫離皿底壁（注意邊緣地帶和四角處，吹打力度適中，防止產生傷害細胞的氣泡）。

（5）離心：取吹打后的培養(yǎng)液轉移至15 ml離心管中，離心機1000rpm，5min得到單細胞沉淀。

（6）為節(jié)省時間，可在離心過程中準備傳代所需的培養(yǎng)皿（1:n傳代就準備n個培養(yǎng)皿），各加入9 ml（血清）細胞培養(yǎng)基，在皿蓋上標好培養(yǎng)的細胞種類、細胞代數(shù)、傳代時間和操作人員。

（7）離心好的細胞棄上清得到單細胞沉淀，將細胞沉淀用2-3ml完整培養(yǎng)液重新懸浮，分n份分別加入剛剛的培養(yǎng)皿中，并于光學顯微鏡下觀察細胞密度。酒精噴洗后放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)即可。（10cm皿一皿培養(yǎng)基10ml；T25細胞培養(yǎng)瓶一瓶培養(yǎng)基5ml）。

4.結束操作：

（1）將所有未用完試劑的離心管用封口膜包好，同廢液缸一起拿出超凈臺。

（2）整理移液槍及耗材位置，用酒精噴濕吸水紙擦拭超凈臺，關閉超凈臺燈光。

（3）廢液倒入廢液回收瓶，廢棄耗材裝入黃色專用垃圾袋，等待統(tǒng)一回收處理。試劑放回4℃冰箱中冷藏。

（4）記錄今日實驗操作內容及結果，方便日后回顧。

三、注意事項

1、細胞消化中的注意事項

（1）消化細胞可能會由于商品化胰酶的品牌、實驗室溫度或細胞種類等造成消化時間上的差異，建議第一次消化細胞時在加入胰酶后就轉移至倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)并記錄時間。

（2）消化細胞熟練之后可以觀察到消化完成后的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底壁呈現(xiàn)霧面。

（3）若5min后細胞狀態(tài)沒有明顯變化，可以將培養(yǎng)皿重新放回培養(yǎng)箱在37℃下孵育消化，或者更換別的品牌的胰酶嘗試。

（4）若消化過度則細胞會隨著分散在胰酶中，此時棄去胰酶終止消化會造成細胞的損失，應加入含血清的培養(yǎng)基終止消化后離心去除。

（5）若細胞未全部消化就終止消化，細胞會貼在皿底很難吹打下來，可以再加入胰酶重新消化。

2、細胞傳代時的注意事項

（1）首先可以在ATCC上查找細胞的傳代比例，然后根據(jù)細胞培養(yǎng)的狀態(tài)判斷傳代的合適比例。若細胞傳代過稀則可能會導致細胞不能擴增，若過密則影響細胞生長狀態(tài)。

（2）細胞傳代天數(shù)的控制也很重要。若長時間不傳代，細胞培養(yǎng)基顏色變黃，則證明培養(yǎng)基中的pH發(fā)生變化，會影響細胞狀態(tài)。

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